Comentaris viruslents (47): un al·legat a favor de les RCPs

Un article del Dr. Xavier Abad, viròleg i Cap de la Unitat d’Alta Biocontenció de l’IRTA-CReSA, extret del seu blog “Comentaris viruslents”, sobre preguntes i respostes de les proves PCRs.

 

Foto: Dean Calma/IDAEA (CC BY 2.0)

He llegit darrerament algunes entrades a twitter i comentaris en blogs que malparlen de la PCR, sí, les RCPs serien la denominació catalana, tot era per despistar un xic, amb arguments, alguns, molt peregrins. Aquí us dono quatre dades i comentaris pel que fa a aquesta tècnica, relacionades amb SARS-CoV-2 des del meu punt de vista.

Les PCRs no detecten el virus sencer?

No, la PCR és una tècnica diagnòstica en què ha de primar la rapidesa i l’especificitat. El genoma dels coronavirus té 30.000 nucleòtids i, per tant, no té sentit amplificar-los tots. El que ens interessa és haver identificat la presència del virus fent servir dues o tres seqüències que siguin especifiques i altament conservades (és a dir, que es trobin a tots els diferents aïllaments del virus, de SARS-CoV-2) i no descrites en altres virus que ens permetin fer amplificacions específiques.

Podem seqüenciar el virus sencer? Sí, molt més ràpid que fa uns anys, però tot i així és un procés molt més lent que una qRT-PCR (que es podria transcriure com Transcripció Reversa-Reacció en Cadena de la Polimerasa quantitativa, o en temps real). Quan es tracta de tenir resultats en unes hores perquè d’això depèn un confinament, una definició de contacte a aïllar, o d’un clúster, el “driver” és la rapidesa. No és que no es pugui, és que no facilita la presa de decisions. I de tota manera sempre hi ha una fracció que sí que es porta a seqüenciar, però sense la pressió del rellotge assistencial per poder fer estudis de com varia el virus, si és que varia, a diferents zones geogràfiques, quin és l’origen, etc. Però aquests són estudis de context, no estudis executius.

Les PCRs es poden contaminar?

I tant, tothom que ha treballat en un laboratori de microbiologia, o específicament virologia, sap que les amplificacions poden portar a contaminacions. No obstant, hi ha controls, suficients per posar-la de manifest i descartar la prova i repetir-la. També hi ha controls positius i negatius d’extracció, controls positius i negatius d’amplificació, etc. Aquests controls apliquen tant a les PCRs directes, aquelles que ja parteixen de ADN, com a les “indirectes”, les RT-PCR que necessiten una etapa prèvia de conversió d’ARN en ADN, una transcripció reversa o Reverse Transcription (RT, en anglès) per amplificar després aquest darrer.

La transcripció reversa NO amplifica, només ens canvia o ens transforma l’ARN (si n’hi ha) per ADN. Com a recordatori, les PCRs (en femení perquè són “reaccions”) són reaccions enzimàtiques en les quals un enzim permet fer una còpia idèntica d’un fragment de doble cadena de ADN. Per tant, en un cicle passaríem de tenir una cadena a dues, en el segon cicle de dues a quatre, en el tercer de quatre a vuit, i si apliquem el concepte 2n on “n” és el numero de reaccions veuran que amb 10 cicles per exemple ja tindrien dobles 1024 cadenes.

La majoria de les reaccions d’amplificació tenen entre 35 i 40 cicles. Recordin que el coronavirus, com molts altres virus respiratoris (el virus de la grip per exemple, però aquest està constituït per segments mentre que el coronavirus és una única cadena) és un virus ARN, així que d’ara en endavant en aquesta entrada parlarem de RT-PCR, o més concretament de qRT-PCR, que, com hem dit abans, seria Transcripció Reversa-Reacció en Cadena de la Polimerasa quantitativa. Aquesta reacció doble es pot fer tota ella en un sol tub, i ja va emprar-se en la pandèmia pel virus H1N1 l’any 2009, i el que cerca és amplificar milions de vegades un “petit fragment específic” del SARS-CoV-2; les “comentes” que acabo de posar tenen importància, les comentarem després.

Un resultat qRT-PCR positiu indica que el virus està present?

Sí, un resultat RT-PCR positiu indica que el virus està present amb una molt alta probabilitat, però no informa de l’estat (infecciós o no) d’aquest virus, només indica que el seu ARN estava present en la mostra. Si una persona no mostra símptomes el que ens indica és que el virus està replicant-se i/o bé esdevindrà simptomàtic o estem davant d’una persona pre-simptomàtica que al cap d’un o dos dies mostrarà simptomatologia. Si la persona mostra símptomes, ens indicarà que aquests són deguts, amb alta probabilitat, al virus SARS-CoV-2.

L’ARN és una molècula que si no està protegida es degrada amb certa facilitat. Si detecten ARN en quantitats importants a la mostra vol dir que està dins dels embolcalls i càpsides víriques senceres, íntegres, que han protegit el àcid nucleic fins que nosaltres hem extret la mostra i hem trencat aquestes proteccions (mitjançant tampons de lisi). Si no es detecten quantitats importants, és que la persona no està infectada o bé ho està però en els dies inicials, quan el virus acaba d’entrar i està iniciant la seva propagació, un període d’eclipsi. Res és tot o res, instantàniament, tampoc a la virologia.

Però només es detecta el virus SARS-CoV-2?

Sí, les RT-PCR que s’utilitzen ara mateix són extremadament sensibles i eficients per detectar el SARS-CoV-2. Hi ha diverses qRT-PCR que permeten amplificar-lo. I els encebadors (“primers”) i les sondes que s’ha dissenyat s’han fet a partir de seqüències presents en SARS-CoV-2 i no presents en altres coronavirus coneguts (que afecten a humans), o altres virus respiratoris com rinovirus, adenovirus, virus de la grip però també parainfluenzavirus o el virus respiratori sincitial, que no oblidem que també poden estar al nostre cos (a l’estiu amb alta improbabilitat, el mes de novembre o desembre amb una probabilitat molt més alta).

Virus SARS-CoV-2./NIAID (CC BY 2.0)

Virus SARS-CoV-2./NIAID (CC BY 2.0)

Posem un exemple. Imaginem uns encebadors de 15 nucleotids. Nucleòtids? Són les baules que permeten fer la cadena del ADN, de noms guanina (G), citosina ( C), timina (T) i adenina (A). Aquests quatre nucleòtids s’endressen en un ordre concret en aquesta petita cadena, molt curta, que ha de ser complementària al segment específic que hem escollit i que flanqueja la seqüència a amplificar. En certa manera, són les dents d’una cremallera, que “han de casar” amb l’altre banda, per permetre la reacció. Recordin, a més que això passa en dos punts de la cadena del genoma del virus, que potser disten 200 o 300 nucleòtids (genoma del coronavirus? al voltant de 30.000 nucleotids). Això vol dir que tenim 15 posicions independents on pot ser que calgui A, o C, o G, o T, i a cada lloc la probabilitat és ¼. Per tant la probabilitat que la seqüència específica es torni a repetir en la natura, i recordem que ja hem cercat que no coincideixi amb moltes “coses víriques” conegudes, és de ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼… i així fins a 15 vegades. Facin servir la calculadora. I ara multipliquin per dos perquè això també ha de passar a l’altre costat. I ara sumin que la sonda fluorescent també s’uneix específicament entre els dos encebadors, però no emetrà la seva senyal lluminosa fins que es connecti amb el segment amplificant-se, que és el que realment detectem amb l’equip. Sí, detectem solament SARS-CoV-2.

I com sabem això? Perquè tota tècnica diagnòstica s’ha de validar. I què vol dir validar? Vol dir, entre altres coses, matrius diferents (saliva, esput, mucositat nasals, etc.) inoculades amb el virus que ens interessa, SARS-CoV-2, o obtingudes d’un malalt, però també, en proves diferents, tots els altres virus esmentats i confirmar que tenim senyals positives pel primer i no per la resta. I confirmar que això passa amb operadors/treballadors diferents, en dies diferents amb sets de reactius diferents, en màquines diferents, fins i tot. I si això no passa, si tenim senyals positives on no toca, o no tenim senyals positives consistents on toca, s’ajusten les condicions fins assolir-les. I això pot incloure quin és el millor tipus de mostra i com s’ha de conservar aquesta fins que és analitzada. Ens interessa la màxima especificitat sense perdre sensibilitat. I tot està en continua revisió, així que sí, detecten solament SARS-CoV-2.

Però el cultiu cel·lular és més real, ens dona informació de virus infecciosos i no de genomes, oi?

Personalment m’agrada més el cultiu cel·lular, ja que si es volen fer estudis d’inactivació dels virus per desinfectants o per agents físics com la temperatura o la radiació ultravioleta, necessitem anar a cultius cel·lulars perquè ens donaran informació, “in vitro” en aquest cas, en condicions controlades. No obstant, els cultius cel·lulars tenen inconvenients. És gairebé un art, una tècnica lenta (pots necessitar 1 o 2 o 3 setmanes per tenir un resultat), molt cara perquè requereix moltes hores de personal expert, i com dic amb cert art a les mans, i es veu afectat per les condicions d’emmagatzematge i la cadena de fred (es pot deixar una mostra a temperatura ambient o en refrigeració uns dies i es trobarà senyal molecular; i provar de fer el mateix i mirar d’aïllar el virus per cultiu cel·lular i es fracassarà; és el que els vinc comentant, i els hi dic des de les espatlles de gegants, de la “escassa” persistència ambiental dels virus embolcallats). I per acabar-ho d’adobar és una tècnica menys sensible, que la PCR, qRT-PCR en el nostre cas.

Cultiu cel·lular.

Cultiu cel·lular.

Però la RT-PCR també té el seu límit de detecció. No pensem que una qRT-PCR pot detectar 1 sola còpia de ARN transcrita a ADN i multicopiada després. El que passa és que aquest límit és molt més baix que el del cultiu cel·lular. Les dades de cultiu cel·lular es donen habitualment en TCID50/mL i no explicarem ara com s’arriben a aquests valors però sí explicarem, perquè sí és l’objecte, com es donen molts cops els valors de qRT-PCR.

Quan es té una corba patró, que relaciona Cts i concentració ARN per mL, les dades es donen com a còpies ARN/mL però és molt freqüent al laboratori i als mitjans parlar de Ct (o les Cts en plural). Aquest valor marca UN cicle, EL cicle en el que la mostra ha arribat al llindar de positivitat. A partir d’aquell moment la mostra pot ser MÉS positiva, si volen, però en principi ja no serà negativa. Com més baix sigui el numero de cicle, indirectament ens dona una mesura de la concentració del ADN a amplificar; al nostre sistema li costa menys cicles en amplificar i donar senyal positiva. Dos mostres amb Cts de 20 i de 32 són dues mostres positives però una, la primera, molt més carregada de virus que la segona; hi ha 12 cicles de diferència; si multipliquen dos per 12 vegades tindran una estima de la diferència de concentració. Desconfiïn de Cts de 36, o 38, o 40; aquestes mostres són tan feblement positives, que probablement són negatives.

I un apunt final, hi ha moltes còpies defectives, no infeccioses, de virus voltant al costat de (de vegades unes poques) partícules infectives. El procés de multiplicació vírica no està per res exempt d’errades i de fet molts estudis per altres virus indiquen que el número de partícules no infeccioses és (molt) superior al de partícules infeccioses. Des d’aquest punt de vista, la qRT-PCR seria un “surrogate”, una aproximació perquè molt ARN d’aquestes partícules no infectives és encara amplificable.

Però és molt millor veure bé d’un ull i mig veure d’un altre que no veure-s’hi a dos pams. El primer escenari és el que permeten les tècniques diagnòstiques; el segon és no fer res.

Però aquesta, aquesta és una altra història.

Coneix més sobre l'autor d'aquest post:

Cap de la Unitat de Biocontenció IRTA-CReSA. comentarisviruslents.org xavier.abad@irta.cat