Comentarios viruslentos (47): un alegado a favor de las RCPs

Un artículo del Dr. Xavier Abad, virólogo y Jefe de la Unidad de Alta Biocontención del IRTA-CReSA, de su blog «Comentaris viruslents», sobre preguntas y respuestas de las pruebas PCRs.

 

Foto: Dean Calma/IDAEA (CC BY 2.0)

He leído últimamente algunas entradas en twitter y comentarios en blogs que despotrican de la PCR, sí, las RCPs serían la denominación catalana, todo era para despistar un poco, con argumentos, algunos, muy peregrinos. Aquí os doy cuatro datos y comentarios con respecto a esta técnica, relacionadas con SARS-CoV-2, desde mi punto de vista.

¿Las PCRs no detectan el virus entero?

No, la PCR es una técnica diagnóstica en la que debe primar la rapidez y la especificidad. El genoma de los coronavirus tiene 30.000 nucleótidos y, por tanto, no tiene sentido amplificar todos. Lo que nos interesa es haber identificado la presencia del virus utilizando dos o tres secuencias que sean específicas y altamente conservadas (es decir, que se encuentren en todos los diferentes aislamientos del virus, de SARS-CoV-2) y no descritas en otros virus que nos permitan hacer amplificaciones específicas.

¿Podemos secuenciar el virus entero? Sí, mucho más rápido que hace unos años, pero aún así es un proceso mucho más lento que una qRT-PCR (que se podría transcribir como Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa, o en tiempo real). Cuando se trata de tener resultados en unas horas para que de ello depende un confinamiento, una definición de contacto a aislar, o de un clúster, el «driver» es la rapidez. No es que no se pueda, es que no facilita la toma de decisiones. Y de todos modos siempre hay una fracción que sí se lleva a secuenciar, pero sin la presión del reloj asistencial para poder hacer estudios de cómo varía el virus, si es que varía, en diferentes zonas geográficas, cuál es el origen, etc. Pero estos son estudios de contexto, no estudios ejecutivos.

¿Las PCRs se pueden contaminar?

Por supuesto, todo el mundo que ha trabajado en un laboratorio de microbiología, o específicamente virología, sabe que las amplificaciones pueden llevar a contaminaciones. Sin embargo, hay controles, suficientes para ponerlas de manifiesto y descartar la prueba y repetirla. También hay controles positivos y negativos de extracción, controles positivos y negativos de amplificación, etc. Estos controles aplican tanto a las PCRs directas, aquellas que ya parten de ADN, como las «indirectas», las RT-PCR que necesitan una etapa previa de conversión de ARN en ADN, una transcripción reversa o Reverse Transcription (RT, en inglés) para amplificar después este último.

La transcripción reversa NO amplifica, sólo nos cambia o nos transforma el ARN (si los hay) en ADN. Como recordatorio, las PCRs (en femenino porque son «reacciones») son reacciones enzimáticas en las que una enzima permite hacer una copia idéntica de un fragmento de doble cadena de ADN. Por tanto, en un ciclo pasaríamos de tener una cadena a dos, en el segundo ciclo de dos a cuatro, en el tercero de cuatro a ocho, y si aplicamos el concepto 2n donde «n» es el número de reacciones verán que con 10 ciclos por ejemplo ya tendrían 1.024 dobles cadenas.

La mayoría de las reacciones de amplificación tienen entre 35 y 40 ciclos. Recuerden que el coronavirus, como muchos otros virus respiratorios (el virus de la gripe por ejemplo, pero éste está constituido por segmentos mientras que el coronavirus es una única cadena) es un virus ARN, así que de ahora en adelante en esta entrada hablaremos de RT-PCR, o más concretamente de qRT-PCR, que, como hemos dicho antes, sería Transcripción Reversa-

Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa. Esta reacción doble se puede hacer toda ella en un solo tubo, y ya se empleó en la pandemia por el virus H1N1 en 2009, y lo que busca es amplificar millones de veces un «pequeño fragmento específico» del SARS-CoV- 2; las «comillas» que acabo de poner tienen importancia, las comentaremos después.

¿Un resultado qRT-PCR positivo indica que el virus está presente?

Sí, un resultado RT-PCR positivo indica que el virus está presente con una muy alta probabilidad, pero no informa del estado (infeccioso o no) de este virus, sólo indica que su ARN estaba presente en la muestra. Si una persona no muestra síntomas lo que nos indica es que el virus está replicándose y / o se convertirá sintomático o estamos ante una persona pre-sintomática que al cabo de uno o dos días mostrará sintomatología. Si la persona muestra síntomas, nos indicaría que estos son debidos, con alta probabilidad, el virus SARS-CoV-2.

El ARN es una molécula que si no está protegida se degrada con cierta facilidad. Si se detectan ARN en cantidades importantes en la muestra, significa que está dentro de los envoltura y cápsides víricas enteras, íntegros, que han protegido el ácido nucleico hasta que nosotros hemos extraído la muestra y hemos roto estas capas protectoras (mediante tampones de lisis). Si no se detectan cantidades importantes, es que la persona no está infectada o bien lo está pero en los días iniciales, cuando el virus acaba de entrar y está iniciando su propagación, un período de eclipse. Nada es todo o nada, instantáneamente, tampoco a la virología.

¿Pero sólo se detecta el virus SARS-CoV-2?

Sí, las RT-PCR que se utilizan ahora mismo son extremadamente sensibles y eficientes para detectar el SARS-CoV-2. Hay varias qRT-PCR que permiten amplificarlo. Y los cebadores («primers») y las sondas que se ha diseñado se han hecho a partir de secuencias presentes en SARS-CoV-2 y no presentes en otros coronavirus conocidos (que afectan a humanos), u otros virus respiratorios como rinovirus, adenovirus, virus de la gripe pero también parainfluenzavirus o el virus respiratorio sincitial, que no olvidemos que también pueden estar en nuestro cuerpo (en verano con alta improbabilidad, el mes de noviembre o diciembre con una probabilidad mucho más alta).

Virus SARS-CoV-2./NIAID (CC BY 2.0)

Virus SARS-CoV-2./NIAID (CC BY 2.0)

Pongamos un ejemplo. Imaginemos unos cebadores de 15 nucleótidos. ¿Nucleótidos? Son los eslabones que permiten hacer la cadena del ADN, de nombres guanina (G), citosina (C), timina (T) y adenina (A). Estos cuatro nucleótidos se organizan (o colocan) en un orden concreto en esta pequeña cadena, muy corta, que debe ser complementaria al segmento específico que hemos escogido y que flanquea la secuencia a amplificar. En cierto modo, son los dientes de una cremallera, que «deben casarse» con el otro lado, para permitir la reacción. Recuerden, además que esto ocurre en dos puntos de la cadena del genoma del virus, que quizás distan 200 o 300 nucleótidos (¿genoma del coronavirus? alrededor de 30.000 nucleótidos). Esto quiere decir que tenemos 15 posiciones independientes donde puede que haya que A, o C, o G, o T, y en cada lugar la probabilidad es ¼. Por lo tanto, la probabilidad que la secuencia específica se vuelva a repetir en la naturaleza, y recordamos que ya hemos buscado que no coincida con muchas «cosas víricas» conocidas, es de ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ … y así hasta 15 veces. Utilicen la calculadora. Y ahora multipliquen por dos porque esto también tiene que pasar al otro lado. Y ahora sumen que la sonda fluorescente también se une específicamente entre los dos cebadores, pero no emitirá su señal luminosa hasta que se conecte con el segmento amplificándose, que es lo que realmente detectamos con el equipo. Sí, detectamos sólo SARS-CoV-2.

¿Y cómo sabemos esto? Porque toda técnica diagnóstica debe validarse. ¿Y qué significa validar? Quiere decir, entre otras cosas, matrices diferentes (saliva, esputo, mucosidades nasales, etc.) inoculadas con el virus que nos interesa, SARS-CoV-2, u obtenidas de un enfermo, pero también, en pruebas diferentes, todos los otros virus mencionados y confirmar que tenemos señal positivas para el primer y no para el resto. Y confirmar que esto ocurre con operadores / trabajadores diferentes, en días diferentes con sets de reactivos diferentes, en máquinas diferentes, incluso. Y si esto no ocurre, si tenemos señales positivas donde no toca, o no tenemos señales positivas consistentes donde toca, se ajustan las condiciones hasta alcanzarlas. Y esto puede incluir cuál es el mejor tipo de muestra y cómo se debe conservar esta hasta que es analizada. Nos interesa la máxima especificidad sin perder sensibilidad. Y todo está en continua revisión, así que sí, detectan solamente SARS-CoV-2.

Pero el cultivo celular es más real, nos da información de virus infecciosos y no de genomas, ¿verdad?

Personalmente me gusta más el cultivo celular, ya que, si se quieren hacer estudios de inactivación de los virus para desinfectantes o por agentes físicos como la temperatura o la radiación ultravioleta, necesitamos ir a cultivos celulares que nos darán información, «in vitro» en este caso, en condiciones controladas. Sin embargo, los cultivos celulares tienen inconvenientes. Es casi un arte, una técnica lenta (puedes necesitar 1 o 2 o 3 semanas para tener un resultado), muy cara porque requiere muchas horas de personal experto, y como digo con cierto arte en las manos, y se ve afectado por las condiciones de almacenamiento y la cadena de frío (se puede dejar una muestra a temperatura ambiente o en refrigeración unos días y se encontrará señal molecular; intentar hacer lo mismo y tratar de aislar el virus por cultivo celular y se fracasará; es lo que vengo comentando, y lo digo desde los hombros de gigantes, de la «escasa» persistencia ambiental de los virus envueltos). Y por si fuera poco es una técnica menos sensible, que la PCR, qRT-PCR en nuestro caso.

Cultiu cel·lular.

Cultivo celular./Wikimedia Commons

Pero la RT-PCR también tiene su límite de detección. No pensemos que una qRT-PCR puede detectar 1 sola copia de ARN transcrito a ADN y multicopiada después. Lo que pasa es que este límite es mucho más bajo que el del cultivo celular. Los datos de cultivo celular se dan habitualmente en TCID50 / mL y no explicaremos ahora cómo se llegan a estos valores pero sí explicaremos, porque sí es el objeto, como se dan muchas veces los valores de qRT-PCR.

Cuando se tiene una curva patrón, que relaciona Cts y concentración ARN por mL, los datos se dan como copias ARN / mL pero es muy frecuente en el laboratorio y los medios hablar de Ct (o las Cts en plural). Este valor marca UN ciclo, EL ciclo en el que la muestra ha alcanzado el umbral de positividad. A partir de ese momento la muestra puede ser más positiva, si quieren, pero en principio ya no será negativa. Cuanto menor sea el número de ciclo, indirectamente nos da una medida de la concentración del ADN a amplificar; a nuestro sistema le cuesta menos ciclos en amplificar y dar señal positiva. Dos muestras con Cts de 20 y de 32 son dos muestras positivas pero una, la primera, mucho más cargada de virus que la segunda; hay 12 ciclos de diferencia; si multiplican dos por 12 veces tendrán una estima de la diferencia de concentración. Desconfíen de Cts de 36, o 38, o 40; estas muestras son tan débilmente positivas, que probablemente son negativas.

Y un apunte final, hay muchas copias defectivas, no infecciosas, de virus alrededor de (a veces unas pocas) partículas infectivas. El proceso de multiplicación vírica no está para nada exento de errores y de hecho muchos estudios para otros virus indican que el número de partículas no infecciosas es (muy) superior al de partículas infecciosas. Desde este punto de vista, la qRT-PCR sería un “surrogate”, una aproximación porque mucho ARN de estas partículas no infectivas es todavía amplificable.

Pero es mucho mejor ver bien de un ojo y medio ver de otro que no ver a dos palmos. El primer escenario es el que permiten las técnicas diagnósticas; el segundo es no hacer nada.

Pero esta, esta es otra historia.

Conoce algo más al autor de este post:

Cap de la Unitat de Biocontenció IRTA-CReSA. comentarisviruslents.org xavier.abad@irta.cat