Aplicación de MALDI-TOF para la identificación y diferenciación de patógenos causantes de mastitis a partir de muestras de leche y muestras no lácteas

La técnica de MALDI-TOF  (“Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight“) es un método rápido y fiable, que es capaz de identificar una gran variedad de bacterias una vez aisladas. El MALDI-TOF funciona mediante el uso de excitación de proteínas por láser para crear un patrón de espectro único para cada microorganismo.

Los pérfiles creados por esta técnica pueden considerarse como huellas dactilares, ya que dichos perfiles varían considerablemente entre microorganismos. Los resultados se comparan con miles de espectros en una base de datos de referencia, a partir de la cual se llega a una identificación bacteriana. Este ensayo proporciona una nueva plataforma de diagnóstico que supera las limitaciones de los diagnósticos tradicionales, que requieren mucho tiempo y son laboriosos, y elimina la necesidad de la fermentación de azúcares o el uso de kits de identificación. En los últimos años, los estudios de investigación han mostrado que el MALDI-TOF es una herramienta de diagnóstico poderosa y fiable para la identificación y discriminación de patógenos causantes de mastitis (inflamación de la glandula mamaria), incluidos los estafilococos no aureus (NAS) de la mastitis bovina. Estudios de investigación anteriores describieron el uso del MALDI-TOF para la identificación de NAS a partir de leche, pero el ensayo nunca se había estudiado para identificación de NAS de muestras no lácteas o ambientales.

El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de tipado del ensayo MALDI-TOF para la identificación y diferenciación de especies NAS de bovinos en muestras de leche y muestras de piel de los pezones asépticamente recolectadas.

Se seleccionaron aleatoriamente de 14 a 20 vacas con un elevado recuento de células somáticas (indicador de mastitis) de 8 rebaños lecheros. De estos animales se recogieron hisopos de piel de pezones y muestras de leche cruda de los cuartos traseros derecho e izquierdo. Estas muestras se recogieron de forma aséptica para su identificación preliminar utilizando el cultivo bacteriano. Las colonias de muestras con sospecha clínica de tener NAS se identificaron a nivel de especie mediante MALDI-TOF.

De los 511 aislados de 284 cuartos (142 vacas), el 78% (n = 399) fueron identificados por MALDI-TOF. El porcentaje de NAS correctamente identificado de la leche (91%, 105/115) con MALDI-TOF fue mayor que el porcentaje de la piel de los pezones (68%, 268/396). De los aislados identificados, el 93% (n = 373) se identificaron con éxito como NAS, mientras que los 26 restantes (7%) mostraron ser otras especies bacterianas. De esos 26 aislamientos diferentes, 1 se originó a partir de leche (Corynebacterium stationis), mientras que 25 se originaron a partir de piel de pezón: Aerococcus viridans (n ​​= 7), Bacillus pumilus (n = 13), Enterococcus saccharolyticus (n = 1), Clostridium septicum (n = 1), Corynebacterium stationis (n = 2) y Corynebacterium casei (n = 1). El MALDI-TOF identificó 85 (98/115) y 62% (245/396) de los aislados en la primera prueba. Los aislados que no se identificaron a nivel de especie en la primera prueba se sometieron a una segunda prueba y se identificaron 47 (8/17) y 32% (48/151) de piel de leche y pezón, respectivamente. Después de 2 rondas de MALDI-TOF, el 22% (n = 112) de los aislamientos no se identificaron, lo que representa 103 de la piel de los pezones y 9 de la leche. Dieciocho aislamientos sin identificación por MALDI-TOF se identificaron con éxito a nivel de especie mediante la secuenciación, donde 16 se identificaron correctamente como NAS, mientras los otros dos resultaron ser Corynebacterium stationis.

Estos hallazgos indican que MALDI-TOF es una herramienta valiosa para la identificación y tipificación de las especies de NAS a partir de muestras de leche, pero es menos útil para la identificación de aislados de muestras no lácteas. Además, tanto en la primera como en la segunda ronda, el rendimiento de MALDI-TOF para la identificación de aislados procedentes de la leche fue mayor que para los procedentes de la piel de los pezones. Una posible explicación es que estas bacterias no identificadas de la piel de los pezones provienen de su microbiota natural (bacterias comensales), que no se han incluido previamente en la base de datos presente en el sistema, que tiene una representación principal de agentes patógenos. Además, nuestros hallazgos mostraron que la gran mayoría de los aislamientos de NAS no identificables se originaron a partir de la piel de los pezones. Una explicación razonable podría ser que esos aislamientos son nuevas especies NAS. Otra razón es que estos aislamientos podrían ser especies NAS conocidas pero no están incluidas en nuestra base de datos. Notamos que los aislamientos de NAS que se originan en la piel de los pezones pueden requerir rondas adicionales para su identificación por MALDI-TOF en comparación con los que se originan a partir de la leche. Una posible explicación podría ser que estos aislados bacterianos del ambiente pueden haber desarrollado una capa extra o una cápsula de material proteico como medio de protección contra condiciones ambientales desfavorables.

Estos hallazgos mostraron que MALDI-TOF es un ensayo fiable para la identificación y diferenciación de especies NAS de muestras de leche asépticamente recolectadas. El ensayo se puede usar para la identificación de especies NAS a partir de hisopos de piel de pezones, pero la confirmación con herramientas basadas en ácidos nucleicos es vital para la identificación precisa de algunas especies y cepas.

El estudio ha sido publicado recientemente en la revista Journal of Dairy Science:

Mahmmod IS, Nonnemann B, Svennesen L, Pedersen K, Klaas IC. 2018. Typeability of MALDI-TOF assay for identification of non-aureus staphylococci associated with Bovine intramammary Infections and TEAT apex Colonization. Journal of Dairy Science

Este estudio fue parte del proyecto de investigación «STOPMAST» financiado por la Danish Milk Levy Foundation (Aarhus, Dinamarca). Además, el Dr. Yasser Mahmmod disfrutó de una beca del Programa de Becas Postdoctorales de Mérito (IDB-MSP), Banco de Desarrollo Islámico, Jeddah, Arabia Saudi.

Conoce algo más al autor de este post:

Investigador del Subprograma de Malalties endèmiques. IsDB Merit Research Fellow. Marie Sklodowska-Curie Fellow. yasser.mahmmod@irta.cat