Desenvolupament d’una nova prova d’amplificació isotèrmica mediata per bucle per a la detecció sensible, ràpida i econòmica de diferents genotips del virus de la pesta porcina clàssica

Jose Alejandro Bohorquez, Adriana Muñoz, Saraswathi Lanka, Liani Coronat, Rosa Rosell, Mònica Alberch, Carol W Maddox i Llilianne Ganges.
La pesta porcina clàssica (PPC), una de les malalties més importants de la sanitat animal, continua sent un repte per al control de la malaltia. És causada pel virus de la PPC (VPPC), un virus ssRNA (+), membre del gènere Pestivirus. Les estratègies de control contra la PPC depenen d’un diagnòstic ràpid, principalment proves ELISA per a anticossos anti-CSFV, així com de la detecció molecular de l’ARN viral mitjançant RT-PCR en temps real (RT-qPCR) (OMSA, 2019). Encara que han demostrat ser molt útils, aquestes tècniques requereixen l’ús d’equips especialitzats que no estan fàcilment disponibles en les proximitats de les granges o escorxadors on es realitzen les proves. A més, l’equip especialitzat, i el personal altament qualificat, per a dur a terme les proves RT-qPCR tampoc està fàcilment disponible en molts països en desenvolupament. Això augmenta considerablement el temps necessari per a obtenir un resultat, la qual cosa al seu torn augmenta el temps per a prendre mesures per a controlar la infecció en els ramats afectats.
La PCR d’amplificació isotèrmica mediata per bucle (LAMP) planteja una de les alternatives més interessants, a causa dels seus mètodes de detecció. La LAMP-PCR pot realitzar-se mitjançant detecció fluorimètrica, amb l’ajuda d’equips fàcilment transportables, o fins i tot mitjançant detecció colorimètrica, observable a simple vista. L’objectiu d’aquest estudi va ser dissenyar i validar un nou assaig LAMP per a la detecció ràpida, sensible, específica i econòmica de l’ARN del VPPC en formats fluorimètric i colorimètric per a ser validat juntament amb l’assaig RT-qPCR de referència del VPPC.
Es va desenvolupar una tècnica de PCR d’amplificació isotèrmica mediata per bucle (LAMP), amb engreixadors dissenyats tenint en compte tots els genotips del virus de la pesta porcina clàssica notificats. La reacció es va assajar mitjançant detecció fluorimètrica i colorimètrica, en comparació amb la tècnica de referència. Es van analitzar ceps virals de tres genotips circulants del virus de la pesta porcina clàssica, així com mostres d’animals infectats. També es van assajar altres patògens, per a determinar l’especificitat de la PCR LAMP. A més dels mètodes d’extracció d’ARN en laboratori, es va avaluar un mètode d’escalfament per a l’alliberament d’ARN, fàcilment adaptable a les condicions de camp.
Es van generar tres conjunts d’engreixadors, un dels quals va mostrar un millor rendiment. Aquest conjunt d’engreixadors va demostrar ser capaç de mantenir un rendiment òptim a diverses temperatures d’amplificació (60 °C – 68 °C). Es van analitzar ceps virals de tres genotips circulants del virus de la pesta porcina clàssica, així com mostres d’animals infectats (Figura 1). També es van assajar altres patògens, per a determinar l’especificitat de la PCR LAMP. A més dels mètodes d’extracció d’ARN en laboratori, es va avaluar un mètode d’escalfament per a l’alliberament d’ARN, fàcilment adaptable a les condicions de camp.
Val la pena destacar que l’assaig LAMP, ja sigui per detecció fluorimètrica o colorimètrica, va mostrar una sensibilitat similar a la de l’assaig RT-qPCR del CSFV reportat per Hoffmann et al., 2005, en avaluar mostres d’ARN extretes magnèticament del genotip 1. Per contra, l’ús d’aquesta prova CSFV-LAMP sobre el terreny utilitzant un equip mínim, en particular mitjançant detecció colorimètrica, pot veure’s limitat en intentar analitzar mostres de sèrum, ja que totes elles van resultar negatives en avaluar mostres de sèrum bullides. Això pot deure’s a les capacitats tampó del sèrum, que dificulten la variació del pH de la mescla mestra i, per tant, el canvi colorimètric. En un estudi anterior es va informar de problemes similars en assajos LAMP colorimètrics. En general, aquest fenomen pot resoldre’s mitjançant la dilució del sèrum, com va ocórrer amb les mostres d’animals infectats amb el cep Catalonia del genotip 2 del virus de la pesta porcina clàssica. No obstant això, aquesta possible limitació pot superar-se mitjançant l’ús d’altres mostres mínimament invasives, com a hisops nasals i rectals, que no van mostrar aquests problemes i poden recollir-se de forma menys invasiva i fins i tot amb menys entrenament a l’entorn d’una granja. A més, els resultats obtinguts utilitzant mostres de porcs infectats experimentalment amb el cep del genotip 2 del virus de la pesta porcina clàssica van evidenciar un millor rendiment del mètode de detecció colorimètric que del fluorimètric (Figura 1). La reacció LAMP colorimètrica va coincidir amb el 93,3% dels resultats de la RT-qPCR i va ser capaç de detectar ARN viral en totes les mostres, independentment del mètode d’extracció, després de 14 dies d’infecció. Això és particularment encoratjador, tenint en compte que la càrrega d’ARN viral en alguns dels hisops nasals i rectals als 7 dpi estava prop del límit de detecció de la RT-qPCR

Figura 1. Mostres clíniques d’infecció experimental in vivo per CSFV.
Figura 1. Mostres clíniques d’infecció experimental in vivo per CSFV.
Un possible inconvenient de la prova CSFV-LAMP resideix en la detecció inespecífica del nou ARN viral del OVPV. Aquest resultat no és del tot sorprenent, donada l’estreta proximitat genòmica del OVPV amb el CSFV, així com el fet que l’ARN d’aquest virus pot detectar-se mitjançant la RT-qPCR del CSFV descrita anteriorment per Hoffman et al., 2005. No obstant això, amb els resultats obtinguts amb el format colorimètric, només és possible detectar el OVPV en un resultat dubtós si circula una gran quantitat de càrrega viral. Cal destacar la ràpida capacitat d’aquest virus per a generar anticossos després de la infecció, la qual cosa en qualsevol cas afavoriria la reducció de la càrrega viral circulant i, per tant, la reactivitat creuada del OVPV amb la prova aquí desenvolupada. A més, és poc probable que la reacció creuada de l’assaig LAMP amb OVPV es traslladi a un context de camp, ja que l’únic estudi relatiu a la infecció experimental de porcs amb OVPV va mostrar que la càrrega d’ARN viral detectada en porcs després de la infecció és molt inferior a la utilitzada per a la prova de l’assaig LAMP en el present estudi.
Els resultats del present estudi mostren el desenvolupament d’una eina nova per a la detecció del virus de la pesta porcina clàssica, que pot tenir importants aplicacions en un entorn de camp, on continuen persistint formes subclíniques i cròniques de la malaltia. Algunes d’aquestes formes de la malaltia no poden diagnosticar-se mitjançant les tècniques serològiques utilitzades habitualment en els programes de vigilància, i la seva detecció depèn de l’amplificació de l’àcid nucleic. L’ús conjunt de tècniques de diagnòstic noves i tradicionals podria resultar una alternativa útil per a la detecció precoç del VPPC, la qual cosa es prestaria a una actuació més ràpida i tindria un impacte global positiu en l’erradicació de la malaltia. Per tant, és necessari establir normes i directrius oficials per a l’ús de proves de diagnòstic en el punt d’atenció en els programes de vigilància i control de malalties de declaració obligatòria per a l’OMSA.
Bohórquez JA, Muñoz-Aguilera A, Lanka S, Coronado L, Rosell R, Alberch M, Maddox CW, Ganges L. Development of a new loop-mediated isothermal amplification test for the sensitive, rapid, and economic detection of different genotypes of Classical swine fever virus. Front Cell Infect Microbiol. 2024 Apr 15;14:1372166. doi: 10.3389/fcimb.2024.1372166. PMID: 38686097; PMCID: PMC11056584.